Thanh bên bài viết
Số lượt xem pdf: 35
XÂY DỰNG QUY TRÌNH GIẢI TRÌNH TỰ SANGER CHẨN ĐOÁN CÁC BIẾN THỂ DI TRUYỀN TRÊN GEN DPYD LIÊN QUAN ĐẾN TÍCH LŨY ĐỘC TÍNH THUỐC FLUOROPYRIMIDINES
Nội dung chính của bài viết
Tóm tắt
Giới thiệu: Một số biến thể di truyền trên gen DPYD đã được chứng minh làm suy giảm hoặc mất hoàn toàn hoạt tính enzym dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD), qua đó làm tăng đáng kể nguy cơ ngộ độc nghiêm trọng, thậm chí tử vong ở bệnh nhân ung thư điều trị bằng fluoropyrimidines. Các biến thể này phân bố trải rộng ở nhiều vùng gen khác nhau, khiến quy trình xét nghiệm phải tiến hành nhiều phản ứng PCR riêng lẻ trước khi giải trình tự gen. Nghiên cứu này đề xuất giải pháp Multiplex PCR kết hợp giải trình tự Sanger nhằm phát hiện đồng thời các biến thể quan trọng trên gen. Cách tiếp cận này giúp rút gọn số bước thao tác, rút ngắn thời gian trả kết quả, mang lại hiệu quả kinh tế và đặc biệt hỗ trợ ra quyết định lâm sàng kịp thời, đảm bảo an toàn cho người bệnh. Mục tiêu: Xây dựng quy trình giải trình tự Sanger chẩn đoán các biến thể di truyền trên gen DPYD liên quan đến tích lũy độc tính thuốc fluoropyrimidines. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: (I) Nghiên cứu thực nghiệm các bước thiết kế 4 cặp đoạn mồi đặc hiệu và tối ưu hóa điều kiện phản ứng Multiplex PCR khuếch đại 04 vùng trình tự khác nhau trên gen DPYD có chứa các biến thể di truyền quan tâm: rs3918290 (DPYD*2A), rs55886062 (DPYD*13), rs67376798 (c.2846A>T) và rs56038477 (c.1236G>A); (II) tối ưu hóa lượng sản phẩm Multiplex PCR cho quá trình giải trình tự Sanger; (III) toàn bộ các bước kỹ thuật được áp dụng trên 05 mẫu DNA bộ gen người tình nguyện nhằm đánh giá chất lượng quy trình. Kết quả: Đã thiết kế thành công 04 cặp đoạn mồi đặc hiệu giúp khuếch đại 4 biến thể quan tâm. Phản ứng Multiplex PCR được tối ưu hóa trong thể tích 25 µL như sau: Q5® High-Fidelity Master Mix (1X), DNA khuôn 50 ng, và cặp mồi với nồng độ tối ưu lần lượt là HaploB3: 0,125 µM; DPYD2A: 0,25 µM; DPYD13: 0,5 µM; D949V: 0,125 µM; thêm nước tinh sạch không chứa nuclease đến đủ thể tích. Chu trình nhiệt: 1 chu kỳ (98 °C 30 s); 35 chu kỳ (98°C 10 s, 58°C 15 s, 72°C 30 s); 1 chu kỳ (72 °C 60 s). Lượng sản phẩm Multiplex PCR tối thiểu từ 20 ng đảm bảo việc giải trình tự Sanger đạt chất lượng. Tất cả 05/05 mẫu DNA bộ gen người tình nguyện có kết quả giải trình tự đạt chất lượng theo khuyến cáo nhà sản xuất và vị trí biến thể quan tâm đều có kết quả QV20+, cho phép dễ dàng kết luận kiểu gen. Kết luận: Đã xây dựng và tối ưu thành công quy trình giải trình tự Sanger để xác định bốn biến thể quan trọng trên gen DPYD
Chi tiết bài viết
Từ khóa
DPYD, rs3918290, rs55886062, rs67376798, rs56038477, Multiplex PCR, Giải trình tự Sanger.
Tài liệu tham khảo
2. Díaz-Villamarín, X., Martínez-Pérez, M., Nieto-Sánchez, et al (2024). Novel Genetic Variants Explaining Severe Adverse Drug Events after Clinical Implementation of DPYD Genotype-Guided Therapy with Fluoropyrimidines: An Observational Study. Pharmaceutics, 16(7), 956.
3. Amstutz, U., Henricks, L. M., Offer, S. M., Barbarino, et al (2018). Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium (CPIC) guideline for dihydropyrimidine dehydrogenase genotype and fluoropyrimidine dosing: 2017 update. Clinical Pharmacology & Therapeutics, 103(2), 210-216.
4. Henricks, L. M., Lunenburg, C. A., de Man, F. M., Meulendijks, et al (2018). DPYD genotype-guided dose individualisation of fluoropyrimidine therapy in patients with cancer: a prospective safety analysis. The Lancet Oncology, 19(11), 1459-1467.
5. Nguyễn Ước Nguyện, Nguyễn Minh Hà, Nguyễn Hữu Ngọc Tuấn và cộng sự (2024). Xây dựng quy trình real-time PCR High Resolution Melting xác định biến thể DPYD*2A trên gen DYPD liên quan chuyển hoá thuốc Fluoropyrimidines. Tạp Chí Y học Việt Nam, 534(1). https://doi.org/10.51298/vmj. v534i1.8093
6. Sint, D., Raso, L., & Traugott, M. (2012). Advances in multiplex PCR: balancing primer efficiencies and improving detection success. Methods in ecology and evolution, 3(5), 898–905. https://doi.org/10.1111/j.2041-210X. 2012.00215.x
7. Babu, L., Reddy, P., Murali, H.S. et al. Optimization and evaluation of a multiplex PCR for simultaneous detection of prominent foodborne pathogens of Enterobacteriaceae . Ann Microbiol 63, 1591–1599 (2013). https://doi.org/ 10.1007/s13213-013-0622-0.
8. Markoulatos, P., Siafakas, N., & Moncany, M. (2002). Multiplex polymerase chain reaction: a practical approach. Journal of clinical laboratory analysis, 16(1), 47–51. https://doi.org/10.1002/ jcla.2058.