Thanh bên bài viết
Số lượt xem PDF: 20
XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHUỘM MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG ĐỂ PHÁT HIỆN OCTN2 TRONG DÒNG TẾ BÀO LYMPHOBLAST NGƯỜI
Nội dung chính của bài viết
Tóm tắt
Bệnh thiếu carnitine nguyên phát (PCD; OMIM #212140) là rối loạn di truyền lặn nhiễm sắc thể thường do biến thể gây bệnh trong gen SLC22A5, mã hóa cho chất vận chuyển carnitine ái lực cao OCTN2. Việc phát hiện chính xác biểu hiện OCTN2 rất quan trọng để hiểu vai trò của nó trong cân bằng carnitine, nhưng các quy trình chuẩn hóa cho dòng tế bào lymphoblast (LCLs)—một mô hình ổn định và dễ tiếp cận—vẫn còn thiếu. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phát triển và tối ưu hóa quy trình nhuộm miễn dịch huỳnh quang (IF) để quan sát OCTN2 trong dòng tế bào LCLs người được biến đổi bởi virus Epstein-Barr (EBV) từ các tình nguyện viên khỏe mạnh. Tế bào được cố định bằng 4% paraformaldehyde (PFA), làm màng thấm, phong tỏa và nhuộm bằng kháng thể sơ cấp chống OCTN2 theo sau là kháng thể thứ cấp liên kết FITC. Việc tối ưu hóa cho thấy PFA vượt trội hơn chất bảo quản tế bào học tổng quát về bảo tồn tính kháng nguyên và hình thái. Thời gian ủ kháng thể sơ cấp 60 phút cho cường độ tín hiệu tối đa (cường độ huỳnh quang trung bình [MFI]: 300 ± 8 đơn vị tùy ý [AU], n=3, p<0,001 so với 30 phút), với cố định trước nhuộm giảm thiểu hiện tượng giả. Quy trình này có tính lặp lại cao giữa các lần lặp, cho thấy vị trí màng plasma rõ ràng với nền thấp, và tương thích với phân tích dòng chảy để định lượng. Đây là phương pháp IF được xác thực đầu tiên cho OCTN2 trong LCLs, cung cấp công cụ vững chắc để nghiên cứu biểu hiện chất vận chuyển trong nghiên cứu chuyển hóa.
Chi tiết bài viết
Từ khóa
Bệnh thiếu carnitine nguyên phát; Nhuộm miễn dịch huỳnh quang OCTN2; Dòng tế bào lymphoblast; Hiển vi huỳnh quang; Cố định paraformaldehyde.
Tài liệu tham khảo
2. Rose EC, et al. Genotype–phenotype correlation in primary carnitine deficiency. Hum Mutat. 2012;33(1):118-23. doi:10.1002/humu.21607.
3. Koleske ML, et al. Functional genomics of OCTN2 variants informs protein-specific variant effect predictor for carnitine transporter deficiency. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022;119(42): e2210247119. doi:10.1073/pnas. 2210247119.
4. Magoulas PL, El-Hattab AW. Systemic primary carnitine deficiency: overview of clinical manifestations, diagnosis, and management. Orphanet J Rare Dis. 2012;7:68. doi:10.1186/ 1750-1172-7-68.
5. Longo N. Primary carnitine deficiency and newborn screening for disorders of the carnitine cycle. Ann Nutr Metab. 2016;68(Suppl 3):5-9. doi:10.1159/000448321.
6. Tamai I, et al. Molecular and functional identification of sodium-dependent, high-affinity human carnitine transporter OCTN2. J Biol Chem. 1998;273(32): 20378-82. doi:10.1074/jbc.273.32. 20378.
7. Wu X, et al. cDNA sequence, transport function, and genomic organization of human OCTN2. Biochem Biophys Res Commun. 1998;246(3):589-95. doi:10.1006/bbrc.1998.8669.
8. Im K, et al. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods Mol Biol. 2019;1897: 299-311. doi:10.1007/978-1-4939-8935-5_26.