XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN NẤM CANDIDA SPP. BẰNG PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR

Tóm tắt

Mở đầu: Theo Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Mỹ (Centers for Disease Control and Prevention - CDC) và Mạng lưới an toàn chăm sóc sức khỏe quốc gia của Mỹ, Candida spp. được xếp ở vị trí thứ 5 trong các tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và đứng thứ 4 trong số các tác nhân gây nhiễm khuẩn máu. Hiện nay, tại Việt Nam, khuynh hướng dịch chuyển này cũng đang xảy ra với tỉ lệ nhiễm cao nhất ở 04 loài Candida albicans, Candida glabrata, Candida parapsilosis và Candida tropicalis. Tuy nhiên, các phương pháp truyền thống phát hiện các loài thuộc chi Candida tuy dễ thực hiện nhưng có nhiều nhược điểm: phụ thuộc vào yếu tố khách quan, tốn nhiều thời gian, dẫn đến chỉ định điều trị không nhanh chóng và kịp thời. Các phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử có nhiều ưu điểm trong phát hiện, định danh tác nhân vi sinh vật gây bệnh. Mục tiêu: Nghiên cứu này thực hiện với 2 mục tiêu: (1) Xác định và tối ưu hóa điều kiện multiplex PCR phát hiện 04 nấm C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis và C. parapsilosis. (2) Xây dựng quy trình phát hiện đồng thời 04 loài nấm C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis và C. parapsilosis bằng phương pháp multiplex PCR. Phương pháp: Các mẫu Candida spp. được thu nhận tại Bệnh viện Đại học Y Dược TP. HCM, Bệnh viện Lê Văn Thịnh và Bệnh viện Quân Y 175 từ tháng 10/2020 đến tháng 5/2021. Vi nấm được phát hiện bằng các phương pháp: (1) thử nghiệm tạo ống mầm, (2) phân lập trên môi trường CHROMagar Candida, (3) tối ưu hóa quy trình phát hiện Candida spp. bằng kỹ thuật Multiplex PCR và sử dụng quy trình tối ưu trong phát hiện Candida spp. từ mẫu bệnh phẩm và (4) giải trình tự 5 sản phẩm khuếch đại để kiểm tra tính đặc hiệu. Sau đó, tiến hành so sánh và biện luận kết quả phát hiện Candida spp. bằng 3 phương pháp: thử nghiệm tạo ống mầm, CHROMagar Candida và Multiplex PCR. Kết quả: 40 mẫu bệnh phẩm được phát hiện bằng vào 3 phương pháp: thử nghiệm tạo ống mầm: phát hiện 13 loài C. albicans và 27 loài non-albicans Candida, nuôi cấy môi trường CHROMagar Candida: phát hiện 18 loài C. albicans, 5 loài C. tropicalis, 3 loài C. glabrata và 14 loài non-albicans Candida. Với multiplex PCR: phát hiện 18 loài C. albicans, 7 loài C. tropicalis, 8 loài C. glabrata, 6 loài C. parapsilosis và 1 loài không xác định được. Các thành phần Multiplex PCR phát hiện 4 loài Candida được tối ưu trong 1 ống eppendorf: dung dịch đệm PCR 10 X 2,2 µl; MgSO4 25 mM 0,6 µl; Taq DNA polymerase 5 UI/µl 0,3 µl; dNTP 10 mM 0,5 µl, mồi F_alb 5 pmol 0,3 µl; R_alb 5 pmol 0,5 µl; F_tro 5 pmol 0,3 µl; F_para 5 pmol 0,6 µl; R_para 5 pmol 0,6 µl; F_gla 5 pmol 0,3 µl; R_gla 5 pmol 0,3 µl; dịch chiết DNA 1 µl; nước khử khoáng vừa đủ 25 µl. Chương trình PCR được tối ưu: giai đoạn biến tính ban đầu 95 ^oC 5 phút (1 chu kỳ), giai đoạn 2 (40 chu kỳ): biến tính 95 ^oC 30 giây, gắn mồi 59 ^oC 30 giây, kéo dài mồi 72 ^oC 30 giây; giai đoạn kéo dài cuối cùng 72 ^oC 8 phút (1 chu kỳ).