Thanh bên bài viết
Số lượt xem PDF: 59
XÂY DỰNG QUY TRÌNH REAL-TIME PCR HIGH RESOLUTION MELTING XÁC ĐỊNH BIẾN THỂ DPYD*2A TRÊN GEN DYPD LIÊN QUAN CHUYỂN HOÁ THUỐC FLUOROPYRIMIDINES
Nội dung chính của bài viết
Tóm tắt
Giới thiệu: Biến thể di truyền DPYD*2A trên gen DPYD gây ra sự suy giảm chức năng enzyme dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD), ảnh hưởng mạnh mẽ đến quá trình chuyển hoá thuốc fluoropyrimidines trong tế bào cũng như sự tích luỹ độc tính, đe doạ tính mạng người dùng. Hiệp hội Dược Di truyền (CPIC) đã khuyến cáo rằng các bệnh nhân cần được thực hiện xét nghiệm xác định biến thể DPYD*2A trước khi tiếp nhận điều trị với fluoropyrimidines. Hiện nay, các xét nghiệm kỹ thuật phân tử đóng vai trò quan trọng trong xác định biến thể di truyền, tuy nhiên, do chi phí thực hiện còn cao, nhiều bệnh nhân chưa thể dễ dàng tiếp cận và thực hiện. Vấn đề này cũng dẫn đến sự chần chừ và trì hoãn của các bác sĩ lâm sàng trong việc ra chỉ định xét nghiệm và điều chỉnh liều fluoropyrimidine ban đầu. Việc xây dựng một quy trình kỹ thuật phân tử tiện lợi, tiết kiệm thời gian, với mức giả phải chăng và vẫn đảm bảo độ tin cậy cao như real-time PCR High resolution melting (HRM) xác định biến thể DPYD*2A là kịp thời và cần thiết trong hỗ trợ bác sĩ lâm sàng quản lý hiệu quả tình trạng ngộ độc fluoropyrimidines cũng như giúp bệnh nhân ung thư loại bỏ gánh nặng kinh tế khi thực hiện xét nghiệm di truyền. Mục tiêu: Xây dựng quy trình real-time PCR HRM xác định biến thể DPYD*2A trên gen DPYD liên quan chuyển hoá fluoropyrimidines. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Xây dựng các DNA plasmid chứng giả lập các kiểu gen biến thể DPYD*2A bằng phương pháp tạo đột biến có định hướng và tạo dòng từ chính mẫu máu người tình nguyện tham gia nghiên cứu. Ứng dụng phần mềm tin-sinh học thiết kế cặp đoạn mồi và tiến hành đánh giá độ đặc hiệu đoạn mồi đã thiết kế khi tham gia phản ứng khuếch đại vùng gen DPYD quan tâm. Tiến hành đánh giá độ chính xác và khả năng phân biệt tốt các kiểu gen biến thể DPYD*2A. Kết quả: Đã tạo thành công DNA plasmid alen G (wild-type) và alen A (biến thể) để đóng vai trò là các mẫu chứng kiểu gen biến thể DPYD*2A. Đã xây dựng thành công quy trình real-time PCR HRM xác định biến thể DPYD*2A trên gen DPYD, cụ thể: (i) Quy trình xây dựng có khả năng phân biệt thành công 3 loại kiểu gen khi phân tích bằng biểu đồ derivative melt curves, aligned melt curves và difference plot; (ii) Quy trình xây dựng có kết quả Tm đạt độ chụm cao khi phân tích với DNA plasmid chứng với %CV từ 0,05 đến 0,06%. Kết luận: Quy trình xây dựng được có thể đưa vào ứng dụng xác định biến thể DPYD*2A trong nghiên cứu. Bước đầu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để khảo sát đặc điểm di truyền DPYD*2A ở quần thể người Việt Nam.
Chi tiết bài viết
Tài liệu tham khảo
2. Caudle K, Thorn C, Klein T, et al. Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium guidelines for dihydropyrimidine dehydrogenase genotype and fluoropyrimidine dosing. Clinical Pharmacology Therapeutics. 2013; 94(6):640-645. doi: 10.1038/clpt.2013.172.
3. Baudhuin LM, Lagerstedt SA, Klee EW, Fadra N, Oglesbee D and Ferber MJJTJOMD. Confirming variants in next-generation sequencing panel testing by Sanger sequencing. 2015; 17(4):456-461.
4. Naushad SM, Hussain T, Alrokayan SA and Kutala VK. Pharmacogenetic profiling of dihydropyrimidine dehydrogenase (DPYD) variants in the Indian population. The Journal of Gene Medicine. 2021; 23(1):e3289.
5. Hussain H and Chong NF-M. Combined overlap extension PCR method for improved site directed mutagenesis. BioMed research international. 2016; 2016.
6. Ncbi. Primer-BLAST. Access date: 31/08/2023. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ index.cgi.
7. University of Utah. uMelt Quartz. Access date: 02/09/2023. https://www.dna-utah.org/ umelt/quartz/um.php.
8. Thermofisher Scientific. Precision in qPCR. 2021. Access date: 01/09/2023. https://www. thermofisher.com/vn/en/home/life-science/pcr/ real-time-pcr/real-time-pcr-learning-center/gene-expression-analysis-real-time-pcr-information/ precision-qpcr.html.