XÂY DỰNG KỸ THUẬT QPCR DÙNG CHẤT HUỲNH QUANG SYBR GREEN ĐỊNH LƯỢNG DNA EBV

Tóm tắt

Giới thiệu: Định lượng nồng độ DNA của EBV trong huyết tương có thể được xem như là một dấu hiệu quan trọng giúp tiên lượng tình trạng bệnh tại từng thời điểm khác nhau trong quá trình điều trị. Hiện nay kỹ thuật qPCR có độ nhạy cao nhằm định lượng DNA EBV được ứng dụng phổ biến trong lâm sàng. Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật qPCR dùng chất huỳnh quang SYBR GREEN định lượng DNA EBV nhằm tăng thêm sự lựa chọn cho các bác sĩ lâm sàng áp dụng phù hợp vào mục đích ứng dụng và điều kiện kinh tế. Mục tiêu: Xây dựng quy trình kỹ thuật qPCR dùng chất huỳnh quang SYBR GREEN định lượng DNA EBV. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Xây dựng plasmind chứa đoạn gen BamHI-W của EBV bằng kỹ thuật DNA tái tổ hợp. Tối ưu hóa phản ứng qPCR dùng chất huỳnh quang SYBR GREEN định lượng DNA EBV. Điều kiện phản ứng liên quan đến thể tích phản ứng, nồng độ đoạn mồi được được giảm đi so với khuyến cáo. Áp dụng qui trình kỹ thuật qPCR vừa xây dựng trên mẫu giả lập phòng thí nghiệm, ghi nhận về các tiêu chí kỹ thuật của phản ứng qPCR, độ chính xác, độ nhạy và độ đặc hiệu. Kết quả: Tạo thành công plasmid chứa đoạn gen BamHI-W của EBV được xác nhận bằng giải trình tự Sanger. Xây dựng thành công quy trình kỹ thuật qPCR dùng chất huỳnh quang SYBR GREEN bao gồm: Phản ứng qPCR ở thể tích phản ứng 10 µL với nồng độ đoạn mồi 500nM thỏa các tiêu chí kỹ thuật của phản ứng PCR. Độ chính xác cao với CV trong một ngày và ba ngày nhỏ hơn 11%, hiệu suất phản ứng E% là 95,67%, giá trị slope là -3.432, hệ số tương quan R2 là 0,999; Ngưỡng giới hạn phát hiện (LOD) của kỹ thuật qPCR là 2.10⁴ copy/µL. Trong thí nghiệm giả lập trên mẫu plamid ghi nhận độ chính xác, độ nhạy và độ đặc hiệu là 100%. Kết luận: Xây dựng thành công quy trình quy trình kỹ thuật qPCE dùng chất huỳnh quang SYBR GREEN định lượng DNA EBV.