XÂY DỰNG BỘ CÔNG CỤ CHẨN ĐOÁN BIẾN THỂ ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTIT RS738409 TRÊN GEN PNPLA3 BẰNG KỸ THUẬT REALTIME PCR SỬ DỤNG CHẤT PHÁT HUỲNH QUANG SYBR

Tóm tắt

Giới thiệu: Biến thể đa hình đơn nucleotit rs738409 của gen PNPLA3 ảnh hưởng trực tiếp đến sự sản xuất và phân huỷ chất béo trong tế bào gan. Kỹ thuật real-time PCR phân tích rs738409 được phát triển giúp xác định biến thể đa hình đơn nucleotit bằng các trang thiết bị cơ bản, không đòi hỏi những hoá chất đắt tiền và đem lại hiệu quả chẩn đoán với độ tin cậy cao. Việc xác định thông tin về rs738409 với chi phí tối thiểu là tiền đề thuận lợi cho các nghiên cứu về ảnh hưởng của rs738409 lên tình trạng bệnh lý NAFLD, góp phần tích cực vào sự phát triển y học cá thể hóa. Mục tiêu: Xây dựng bộ công cụ chẩn đoán biến thể đa hình đơn nucleotit rs738409 trên gen PNPLA3 bằng kỹ thuật real-time PCR sử dụng chất phát huỳnh quang SYBR. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Xây dựng quy trình real-time PCR bằng cặp đoạn mồi tự thiết kế để chẩn đoán biến thể rs738409 trên gen PNPLA3 bằng công cụ primer-BLAST (NCBI, Hoa Kỳ). Đánh giá độ đặc hiệu, tối ưu hóa nồng độ của đoạn mồi đã thiết kế. Tạo các dòng DNA plasmid mang lần lượt biến thể C và biến thể G của rs738409 bằng phương pháp TA cloning. Thẩm định khả năng xác định kiểu gen của biến thể rs738409 trên gen PNPLA3 thông qua phản ứng real-time PCR với bộ DNA plasmid chứng giả lập các kiểu gen biến thể quan tâm bằng bộ sinh phẩm SensiFAST SYBR (Bioline). Áp dụng quy trình lên 147 mẫu đã được khẳng định kết quả kiểu gen biến thể bằng giải trình tự Sanger để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, độ xác thực của quy trình đã xây dựng. Kết quả: Xây dựng thành công quy trình kỹ thuật real-time PCR SYBR chẩn đoán biến thể rs738409 trên gen PNPLA3. Các đoạn mồi đặc hiệu alen đạt độ đặc hiệu khi kiểm tra bằng điện di mao quản và phân tích đường cong nóng chảy. Nồng độ tối ưu của các đoạn mồi là 250 nM, với CV% giá trị Ct giữa các lần lặp lại phản ứng đều nhỏ hơn 11% và giá trị Ct trung bình trong khoảng 25-30. Xác định được giá trị |ΔCt| bằng 3 là khoảng phân biệt các kiểu gen của biến thể (CV% nhỏ hơn 11%). Độ nhạy, độ đặc hiệu, độ xác thực của kỹ thuật lần lượt là 98,6%, 100% và 99,3%. Kết luận: Đã xây dựng thành công quy trình kỹ thuật real-time PCR SYBR để xác định biến thể rs738409 trên gen PNPLA3.